檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證
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檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證包括方案的起草及審批，檢測(cè)儀器的確認(rèn)，適用性驗(yàn)證（包括準(zhǔn)確度試驗(yàn)、精密度測(cè)定、線性范圍試驗(yàn)、專屬性試驗(yàn)等）和結(jié)果評(píng)價(jià)及批準(zhǔn)四個(gè)的方面。今天和家一起學(xué)習(xí)這4個(gè)方面的注意事項(xiàng)及檢出限的詳細(xì)計(jì)算方法。
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檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的基本步驟
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首先是制定驗(yàn)證方案，然后對(duì)大型精密儀器進(jìn)行確認(rèn)，最關(guān)鍵的一步是檢驗(yàn)方法的適用性試驗(yàn)，最后是檢驗(yàn)方法評(píng)價(jià)及批準(zhǔn)。
1、驗(yàn)證方案的制定
檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證方案通常由質(zhì)量驗(yàn)證小組提出。根據(jù)產(chǎn)品的工藝條件、原輔料化學(xué)結(jié)構(gòu)、中間體、分解產(chǎn)物查閱有關(guān)資料，提出規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，確定檢查項(xiàng)目，規(guī)定雜質(zhì)限度，即為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。
根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案確定檢查和試驗(yàn)范圍，對(duì)檢驗(yàn)方法擬定具體操作步驟，最后經(jīng)有關(guān)人員審批方可實(shí)施。
2、大型精密儀器的確認(rèn)
分析測(cè)試中所用的檢測(cè)儀器一般可分為三類：
A、普通儀器：
崩解儀，折光儀、分析天平、酸度計(jì)、溶點(diǎn)測(cè)定儀、電導(dǎo)儀等；
B、較精密儀器：
旋光儀、永停滴定儀、費(fèi)休氏水分測(cè)定儀、 自動(dòng)滴定儀、藥物溶出度儀、可見分光光度計(jì)、電泳儀等；
C、大型精密儀器：
紫外分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)、氣相色譜儀、高效液相色譜儀、薄層掃描儀等。
為了保證分析測(cè)試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，每臺(tái)檢測(cè)儀器在投入正式使用之前都應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)。
檢測(cè)儀器的確認(rèn)是檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的基礎(chǔ)，應(yīng)在其它驗(yàn)證試驗(yàn)開始之前首先完成。
檢測(cè)儀器確認(rèn)工作內(nèi)容應(yīng)根據(jù)儀器類型。技術(shù)性能而定，通常包括：安裝確認(rèn)、校正、適用性預(yù)試驗(yàn)和再確認(rèn)。
3、校正
校正是儀器確認(rèn)及檢驗(yàn)方法驗(yàn)證中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，應(yīng)當(dāng)在驗(yàn)證試驗(yàn)以前進(jìn)行校正。紫外分光光度計(jì)校正包括波長(zhǎng)校正、吸收度測(cè)試、準(zhǔn)確度測(cè)試、雜散光檢查。
氣相色譜儀與高效液相色譜儀均要求做系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。在規(guī)定的色譜條件下測(cè)定色譜柱的最小理論塔板數(shù)。分離度和拖尾因子，并規(guī)定變異系數(shù)應(yīng)不大于2％。
對(duì)于化學(xué)檢驗(yàn)中使用的計(jì)量?jī)x器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均應(yīng)校正。
4、適用性預(yù)試驗(yàn)
儀器的安裝確認(rèn)完成以后，在其功能試驗(yàn)符合要求的情況下，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穼?duì)其進(jìn)行適用性檢查，以確認(rèn)儀器是否符合使用要求。
例如對(duì)熔點(diǎn)測(cè)定儀的適用性預(yù)試驗(yàn)是采用已知溶點(diǎn)的甲硝唑做試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果與已知熔點(diǎn)比較。
紫外分光光度計(jì)可用已知含量的某標(biāo)準(zhǔn)品試驗(yàn)，測(cè)得結(jié)果與已知數(shù)值對(duì)比，確定儀器是否符合使用要求。
在完成上述各項(xiàng)試驗(yàn)工作的同時(shí)，應(yīng)做好相應(yīng)的文件記錄等資料歸檔工作，每一臺(tái)儀器均應(yīng)有一套完整的檔案資料。
5、再確認(rèn)
為了確保儀器處于良好的使用狀態(tài)，對(duì)于一臺(tái)新購(gòu)買的儀器在確認(rèn)工作結(jié)束以后，應(yīng)根據(jù)儀器的類別。確認(rèn)的經(jīng)驗(yàn)制定再確認(rèn)的計(jì)劃。
再確認(rèn)的時(shí)間間隔和內(nèi)容要根據(jù)儀器類別和使用情況決定，一般是3個(gè)月、6個(gè)月或1年。
儀器再確認(rèn)的內(nèi)容通常包括線路連接、附件備品消耗檢查、清潔工作、功能試驗(yàn)、工作日記等，其中重點(diǎn)安裝確認(rèn)中的功能試驗(yàn)。
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檢驗(yàn)方法的適用性驗(yàn)證
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藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的方法適合于相應(yīng)的檢測(cè)要求。
在起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證：在藥物生產(chǎn)方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需進(jìn)行驗(yàn)證。
方法驗(yàn)證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草或修訂說明中。
根據(jù)《中國(guó)藥典》附錄XIXA的原則要求，檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證可分為三種情況處理；
1、無(wú)需驗(yàn)證的方法。
如藥典(包括USP、EP、CP、JP等各國(guó)藥典)的方法，一般只做系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)系統(tǒng)是否符合要求(主要指儀器穩(wěn)定性及柱的分離度是否達(dá)標(biāo))。
2、對(duì)比法。
已在參比實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證過的分析方法，可用對(duì)比試驗(yàn)的方法來(lái)確認(rèn)方法的可靠性，即將本實(shí)驗(yàn)室與參比實(shí)驗(yàn)室用同一方法對(duì)同批樣品所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較(如至少取五個(gè)批號(hào)，每批重復(fù)測(cè)定五次)，判斷方法在本實(shí)驗(yàn)室的可行性。
如有差異需查明原因或設(shè)計(jì)方案，對(duì)方法進(jìn)行再驗(yàn)證。
3、需進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證的方法。
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檢驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)及批準(zhǔn)
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安裝確認(rèn)及適用性試驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)將試驗(yàn)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行匯總分析。對(duì)檢驗(yàn)方法作出正確的評(píng)價(jià)，驗(yàn)證報(bào)告的說明及結(jié)論部分應(yīng)簡(jiǎn)明扼要。
試驗(yàn)中的主要偏差應(yīng)有適當(dāng)解釋。然后，報(bào)主管領(lǐng)導(dǎo)審批。檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的最終產(chǎn)物是一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的方法—根據(jù)驗(yàn)證的結(jié)果制訂的由有關(guān)領(lǐng)導(dǎo)批準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法。
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檢出限的詳細(xì)計(jì)算
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在如何正確或準(zhǔn)確地估算檢出限的問題上,國(guó)際分析界一直存有爭(zhēng)議。檢出限的特殊意義在于可以對(duì)一個(gè)給定的分析方法在低濃度水平的檢測(cè)能力進(jìn)行準(zhǔn)確地評(píng)估，而考察一個(gè)分析方法在低濃度范圍的檢測(cè)性能，可以基于不同的角度或不同的側(cè)重點(diǎn),如可以從最小信號(hào)值與儀器噪音之比來(lái)考察，從方法測(cè)定空白的平均波動(dòng)性來(lái)統(tǒng)計(jì)估算,也可以根據(jù)分析方法校準(zhǔn)曲線的偏差特性來(lái)定量估算等等。
檢出限是評(píng)價(jià)一個(gè)分析方法及測(cè)試儀器性能的重要指標(biāo),所謂“檢出"是指ding性檢出，即判定樣品中存在有濃度高于空白的待測(cè)物質(zhì)。
ACS(美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì))對(duì)這一定義作了更簡(jiǎn)明的概括：檢出限是一個(gè)分析方法能夠可靠地檢測(cè)出被分析物的zui低濃度。
1、檢測(cè)限（limit of detection, LOD）定義:
在樣品中能檢出的被測(cè)組分的zui低濃度（量）稱為檢測(cè)限，即產(chǎn)生信號(hào)（峰高）為基線噪音標(biāo)準(zhǔn)差k倍時(shí)的樣品濃度，一般為信噪比（S/N）2:1或3:1時(shí)的濃度，對(duì)其測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度沒有確定的要求。目前，一般將檢測(cè)限定義為信噪比（S/N）3:1時(shí)的濃度。
2、計(jì)算公式為：
D=3N/S （1）
式中：
N——噪音;
S——檢測(cè)器靈敏度；
D——檢測(cè)限
而靈敏度的計(jì)算公式為：
S=I/Q （2）
式中：
S——靈敏度；
I——信號(hào)響應(yīng)值；
Q——進(jìn)樣量
將式（1）和式（2）合并，得到下式：
D=3N×Q/I (3)
式中：
Q——進(jìn)樣量；
N——噪音；
I——信號(hào)響應(yīng)值。
I/N即為該進(jìn)樣量下的信噪比（S/N），該信噪比可通過工作站對(duì)圖譜進(jìn)行自動(dòng)分析獲得，一般的色譜或質(zhì)譜工作站都可進(jìn)行信噪比分析計(jì)算。這樣檢測(cè)限的計(jì)算方法就變得非常方便了。
3、計(jì)算方法：
實(shí)際計(jì)算時(shí)，檢出限有2種表示方法：一種是進(jìn)樣瓶中樣品檢測(cè)限，一種是針對(duì)原始樣品的方法檢出限。
A、對(duì)第一種檢測(cè)限，只要知道進(jìn)樣量和信噪比即可計(jì)算。如進(jìn)樣瓶中樣品濃度為1 mg/L,在此濃度下的信噪比為300(由工作站分析獲得)，則其檢測(cè)限為：
D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L
也可用絕對(duì)進(jìn)樣量表示，若進(jìn)樣體積為10 ul，則其檢測(cè)限為：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。
B、對(duì)第二種表示方法，需同時(shí)考慮原始樣品的取樣量和提取樣品的定容體積。仍按前述樣品計(jì)算，若取樣量為5克，最后定容體積為5 mL，則方法檢測(cè)限為：
D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg
即當(dāng)原始樣品中待檢物質(zhì)的濃度為0.01mg/kg時(shí)，若取樣量為5g,樣品經(jīng)前處理后定容體積為5mL時(shí),進(jìn)樣瓶中樣品的濃度可達(dá)0.01mg/L（假定回收率為100%）,此時(shí)，在其它給定的分析條件下，能產(chǎn)生3倍噪聲強(qiáng)度的信號(hào)。在實(shí)際檢測(cè)工作中，第二種表示方法更為常見。
4、注意事項(xiàng)
由式（3）可見，信噪比的大小直接關(guān)系到檢測(cè)限的大小。信噪比計(jì)算方法的不同，其比值大小有很大不同，這與計(jì)算信噪比時(shí)基線噪聲峰值的定義方式有關(guān)，一般有三種不同的定義：
A、峰/峰（peak to peak）信噪比，用某一段基線噪聲的平均高度；
B、峰/半峰（half peak to peak）信噪比, 用某一段基線噪聲平均高度的1/2；
C、均方根（RMS）信噪比，用某一段基線噪聲的均方根值計(jì)算。
除此之外，信噪比的計(jì)算結(jié)果還和所取噪聲的位置有很大關(guān)系，取信號(hào)哪一側(cè)基線的噪聲，取多長(zhǎng)一段基線上的噪聲，計(jì)算結(jié)果都很不*相同，有時(shí)相差甚遠(yuǎn)。一般多取樣品峰兩側(cè)的噪聲峰值計(jì)算。
5、檢出限的確定
A、《全球環(huán)境監(jiān)測(cè)系統(tǒng)水監(jiān)測(cè)操作指南》中規(guī)定：給定置信水平為95%時(shí)，樣品測(cè)定值與零濃度樣品的測(cè)定值有顯著性差異即為檢出限：
L = 4.6Sb
式中：
L——方法的最di檢出濃度。
Sb ——測(cè)定次數(shù)為n次的空白平行測(cè)定（批內(nèi)）標(biāo)準(zhǔn)差（重復(fù)測(cè)定20次以上）。
B、國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）規(guī)定對(duì)各種光學(xué)分析方法，可用下式計(jì)算：
L = KSb/S
L——方法的zui低檢出濃度
Sb——空白多次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（吸光度）；
S ——方法的靈敏度（即校準(zhǔn)曲線的斜率）
為了評(píng)估 ，空白測(cè)定次數(shù)必須足夠多，最好能測(cè)20次。國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)極力提倡取k值為3，一般來(lái)說，取相應(yīng)的置信水平大約為90%。
若L=0，并不意味著 ，或檢出限無(wú)限小。這時(shí)需配制一個(gè)濃度略大于零濃度的試樣系列（能產(chǎn)生一個(gè)可測(cè)信號(hào)值）代替全程序空白試驗(yàn)，求出其標(biāo)準(zhǔn)偏差，用來(lái)代替 。
此外，有時(shí)為了工作方便和便于比較，也規(guī)定一個(gè)大家能接受的信號(hào)值作為檢出限，如分光光度法中，規(guī)定吸光度為0.010所對(duì)應(yīng)的濃度即為檢出限L。
C、 美國(guó)EPA SW—846規(guī)定方法中的檢出限為：L=3.143Sb
D、某些分光光度法是以吸光度（扣除空白）為0.010相對(duì)應(yīng)的濃度值或絕對(duì)量為檢出限，這是一種實(shí)驗(yàn)室間的協(xié)定方案。
E、氣相色譜法：檢測(cè)器恰能產(chǎn)生與噪音相區(qū)別的響應(yīng)信號(hào)時(shí)所需進(jìn)入色譜的物質(zhì)最小量為檢出限，一般為噪音的二倍。
F、離子選擇電極法：當(dāng)校準(zhǔn)曲線的直線部分外延的延長(zhǎng)線與通過空白電位且平行于濃度軸的直線相交時(shí)，其交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度值即為該離子色譜所對(duì)電極法的檢出限。
由測(cè)得的空白值計(jì)算出的L值不應(yīng)大于分析方法規(guī)定的zui低檢出濃度值，如大于方法規(guī)定值時(shí)，必須尋找原因降低空白值，重新測(cè)定計(jì)算至合格。
6、校正曲線繪制：
A、按分析方法步驟，通過實(shí)測(cè)濃度和儀器信號(hào)值的直線關(guān)系，確定實(shí)驗(yàn)室條件下的測(cè)定上限。當(dāng)測(cè)定上限低于方法的檢測(cè)上*，只能用實(shí)測(cè)的直線范圍。
B、繪制校正曲線的分析步驟應(yīng)與樣品分析相同，并且不少于5個(gè)濃度值。
C、校正曲線繪制與每批測(cè)定樣品同時(shí)進(jìn)行，對(duì)某些分析方法的校正曲線的斜率穩(wěn)定，批間誤差較小，使用原制校正曲線時(shí)，應(yīng)與樣品同時(shí)測(cè)定2份中等濃度標(biāo)樣和2份空白的平行樣。
測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)的濃度（減去空白）值與原校正曲線相對(duì)應(yīng)的濃度值的相對(duì)偏差，分光光度應(yīng)小于5%；原子吸收法應(yīng)小于10%，否則重新制作校正曲線。
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