作為流動相甲醇和乙腈有什么不同？
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1.吸光度：乙腈HPLC吸收最小（特別是在短波長上小）。所謂HPLC級是除去具有吸收UV的雜質，在規定的波長上吸光度限制在規格值以內。在UV檢測時，產生的噪聲小，因此在進行UV短波長上的高靈敏度分析時乙腈HPLC級最適宜。另外，在UV檢測中的梯度基線上也是乙腈HPLC級產生鬼峰少，雖然，其他與水相溶性高的有機溶劑有各種各樣，但很難能找到比乙腈HPLC級吸收更小的。
2.壓力：乙腈低。根據有機溶劑的種類或混合比率的不同而異,水/乙腈,水/甲醇混合液的比率與輸液壓力的關系中,甲醇與水混合,壓力增高,而乙腈同樣與水混合且并不如此.所以,乙腈一方,在同樣的流速下不在柱內加上多余的壓力.從上述兩項,可以確認使用乙腈的意義,那么,甲醇除了價格以外,還有沒有其化優點呢?
3.洗脫能力：一般而言,乙腈較強.乙腈和甲醇分別用同樣的比率與水混合時,一般情況下,乙腈的洗脫能力強.特別是混合比率低時,從咖啡因和苯酚的洗脫來看,獲得同樣的保留時間,乙腈的比率,只需甲醇的比率的一半以下即可.另一方面,有機溶劑100%或與此極接近時,從胡蘿卜素和膽甾醇來看,常常都是甲醇的洗脫能力強.混合比在50比1等較為特殊時,調制的誤差大,影響保留時間,或平衡化的時間長,乙腈遇到這種情況時,用甲醇的10比1混合代替乙腈,這樣操作方便些.溶劑受溫度影響時,不采用容器定量,而采用重量的方法(考慮比重),可使混合比的誤差減小.
4.分離(洗脫)的選擇性.兩者的差異：乙腈和甲醇在分離的選擇性上不同.由于有機溶劑分子的化學性質(甲醇和乙醇是質子性,乙腈和*是非質子性)不同所致.因此,在用乙腈類不能獲得分離的選擇性,就試用甲醇類看看.
5.峰形：用時出現差異.像水楊酸化合物(在鄰位上具有羧基或甲氧基的苯酚化合物)等,用乙腈類時拖尾大,用甲醇類可抑制.可是,一般情況下,聚合物類反相柱,與硅膠柱相比,更具有峰形寬的傾向,特別是用聚苯乙烯分析柱芳香族化合物等時常見.這在流動相是甲醇時非常顯著,而用乙腈時不明顯.為此,用聚合物類反相用柱時建議采用后者(乙腈類),這是因為乙腈使凝膠膨潤.
6.流動相的脫氣：甲醇與水混合時發熱,多余的溶解空氣較易變為脫出氣泡(脫氣容易).而乙腈由于吸熱冷卻,隨著慢慢回到室溫,產生氣泡,所以要考慮脫氣 (加溫攪拌,過濾膜,He脫氣等).
結論：以上反相色譜法流動相常用的乙腈和甲醇進行了比較.粗略地講是,使用乙腈HPLC級最好,在選擇性,峰形差時試用甲醇HPLC,但根據各種不同性質設計分析條件也是必要的。
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